Técnicas de Coloração

A finalidade da coloração é dar cor a diferentes estruturas que compõem os tecidos. Podem ser usadas substâncias que coram de forma difusa as estruturas (colorações difusas), ou que as coram selectivamente (colorações selectivas).

Os corantes são compostos orgânicos derivados de compostos cíclicos aromáticos (dado apresentarem elevada capacidade de deslocalização electrónica) e a sua associação a moléculas maiores – cromogéneos – leva a transições electrónicas que originam cor. A porção do cromóforo que é responsável pela propriedade da cor é o cromóforo. Os auxocromos, também presentes nos corantes, são grupos substituintes que têm a capacidade de ligar o cromogéneo à substância a ser corada, podendo ser estes grupos amina, átomos de azoto quaternários, grupos ácido sulfónico e grupos carboxilo.

Muitas vezes é necessária a intervenção de uma substância que ligue o corante à estrutura a corar – mordente.

Por vezes, as propriedades espectrais do corante, quando se apresenta em grande concentração de moléculas agregadas, são diferentes daquelas que têm quando monoméricos, resultando na propriedade designada por metacromasia.

Designam-se por fluorocromos aqueles que, excitados por radiação de um determinado comprimento de onda, emitem luz com outro comprimento de onda.

Um corante vital é aquele que é utilizado em células e organismos vivos, dependendo o resultado da coloração das propriedades bioquímicas e da activação fisiológica destas células e organismos.

As colorações progressivas são aquelas em que o tecido alvo é imerso na solução corante até se obter a intensidade de coloração desejada. As colorações regressivas caracterizam-se por, numa fase inicial, todas as estruturas do tecido serem coradas de uma forma intensa; esta coloração é posteriormente removida das estruturas que não se pretendem corar, por perda selectiva do corante, através da sua extração com um solvente.

Os corantes básicos são aqueles cuja propriedade corante é devida ao composto básico da sua molécula e ligam-se preferencialmente à cromatina e às proteínas nucleares. As estruturas que se ligam a estes corantes são denominadas de basófilas. Os corantes ácidos devem conter na sua composição grupos ácidos (aniões). Têm uma afinidade particular para o citoplasma das células e substâncias essenciais, sendo assim denominadas de acidófilas. Os corantes neutros correspondem a compostos cujas propriedades são devidas aos dois compostos das suas moléculas (o ácido e o básico). os seus componentes dissossiam-se quando em contacto com os tecidos e os seus compostos ácidos e básicos associam-se, respectivamente, a componentes celulares acidófilose basófilos. Os corantes indiferentes não possuem grupos capazes de formar sais; são em geral insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos.

A coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) é provavelmente a técnica mais utilizada na coloração dos tecidos, devido à sua simplicidade e à sua capacidade de permitir visualizar uma grande quantidade diferente de estruturas tecidulares. A hematoxilina cora de azul os núcleos, apresentando grande detalhe intranuclear. A eosina cora o citoplasma das células e a maioria das fibras do tecido conjuntivo de forma e intensidade diferentes, variando do rosa ao laranja ou vermelho.

Para melhor visualizar diferentes estruturas que naturalmente (ou de forma anómala) existem nos tecidos, podem utilizar-se corantes que as evidenciam, para além de H&E.

As técnicas que são utilizadas para a coloração do tecido conjuntivo são as tricrómicas, técnicas que selectivamente evidenciam o músculo, fibras de colagénio, fibrina e eritrócitos. São usados três corantes, um dos quais é nuclear. Um dos mais usados corresponde ao Tricrómio de Masson, que cora de vermelho o músculo e a fibrina e de azul esverdeado o colagénio. As técnicas para demonstração do osso tornam-se difíceis pelas características próprias deste tecido.

Para a obtenção de um satisfatório corte em parafina é necessária a descalcificação da componente inorgânica deste tecido. Depois deste passo, o procedimento de rotina é continuado como para os outros tecidos.

O processo do osso mineralizado requer técnicas diferentes das usadas em rotina pois o corte é feito com facas de tungsténio e o osso incluído em resinas acrílicas ou plásticos para lhe conferir rigidez necessária. Um dos métodos de coloração do osso não mineralizado é o tricrómio de Goldner, que permite diferenciar o osso mineralizado (corado a verde) do osteóide (corado a laranja/vermelho). Com esta coloração os núcleos coram de azul acinzentado e a cartilagem de púrpura.

O glicogénio e as mucinas (também apelidadas de mucopolissacáridos) são os dois maiores componentes dos hidratos de carbono. As técnicas empregues para demonstração dos glúcidos podem ser colorações ou técnicas de extração. O Ácido Periódico de Schiff (PAS) é um método muito proveitoso na identifiação de hidratos de carbono, particularmente glicogénio. Algumas mucinas que contêm mucinas neutras na sua composição são potencialmente positivas ao PAS. As substâncias PAS-positivas coram de cor magenta.

Os corantes de Alcian, nomeadamente os azúis de Alcian, são compostos catiónicose formam ligações eletrostáticas com determinados grupos polianióicos carboxil ou sulfato. O Azul de Alcian (AA) tem grande especificidade em corar mucinas ácidas, bem como à intensidade com que cora esses componentes, à insolubilidade da coloração (os tecidos não são afectados por posteriores tratamentos com com água ou alcool e elevada durabilidade da coloração. Este corante cora especifica e intensamente mucinas ácidas, de cor azul.

A substância responsável pela amiloidose (substância amilóide) é constituída por proteínas associadas a mucopolissacáridos, que incluem sulfato de heparina, condroitina e sulfato de dermatano. Pela variedade da sua constituição, as afinidades tintoriais são também variáveis. Actualmente a imuno-histoquímica é um método seguro para a identificação desta substância; no entanto, deverá ser utilizada em conjunto com a coloração Vermelho do Congo. Esta segunda técnica cora a amilóide de laranja.

Os pigmentos e minerais podem ser revelados por coloração ou por métodos histoquímicos. O PAS é o método utilizado para a demonstração de lipofuscinas, corando-as de vermelho claro ou magenta. A Hematoxilina de Mallory e Parker confere ao cobre uma cor azul acinzentada. O Método da prata hexamina de Gomori, modificada por Grocott, é usado na identificação de ácido úrico e uratos, após fixação dos tecidos em álcool, conferindo-lhes uma cor negra. O Azul da Prússia-Perls (AP) é o método de eleição para a identificação da hemossiderina, corando-a de azul. O método da prata de Masson-Fontana é um método redutor de revelação da melanina que se baseia na capacida do pigmento reduzir soluções com prata, formando filmes deste metal. Revela não só a melanina como os seus percursores, corando de negro.

Para a histoquímica dos lípidos, a congelação e corte em micrótomo de congelação (crióstato) é obrigatória , pelo facto do processamento de rotina em parafina e resinas resultarem na extração de grande quantidade destes compostos.

Os lípidos têm afinidade para corantes de Sudan. No caso do Sudan Negro, que cora lípidos de negro, o poder de adsorção da gordura está relacionado com a concentração da coloração, temperatura e estado físico da gordura; a máxima adosrção do corante ocorre perto do ponto de fusão da gordura. Os corantes de Sudan não coram colesterol. O Red Oil O é o melhor corante para a identificação de lípidos por rotina, corando-os de vermelho. Para evidenciar o colesterol, utiliza-se a técnica de Schultz, que cora o colesterol de verde.

Fonte: M. dos Anjos Pires, Fernanda Seixas Travassos, Fátima Gärtner; Atlas de Patologia Veterinária; Lidel; Porto; 2004; pp. 157-171, in ww.fciencias.com/2014/06/26/tecnicas-de-coloracao/, 14/03/17.